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viewlab(viewlab蓝光机v900)

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viewlab(viewlab蓝光机v900)

  你好,朋友们。最近,肌肉金轮的视频在哔哩哔哩火了。相信很多朋友都渴望自己做一个变脸视频。今天给大家找的软件和教程!

  这个软件的名字叫deepfacelab。github上的开源。

  如果你想自己做一个变脸视频,那么软件来了:

  https://dfldata.xyz/forum.php?mod=viewthreadtid=362 extra=page=1

  相应软件使用的教程在这里:

  http://dfldata.xyz/forum.php?mod=viewthreadtid=595

  注意视频中提到的参数设置都是在老鸟进阶(也就是教程的第二部分)

  这个软件对应的github源代码在这里:

  https://github.com/iperov/DeepFaceLab

  (有条件有能力的朋友可以去看看这个。如果是小白,请直接忽略它。)

  因为平台设置和排版问题可能会导致一些小问题,如果不想自己打网址,可以在后台回复换脸软件获取相应网址。

  “五亩房子种桑树,五十人可穿衣帛。”

  3354孟子

  本教程提供了高保真DNA聚合酶Pfu-sso7d的表达和纯化步骤。Sso7d是一种双链DNA结合蛋白。关于Sso7d融合技术的好处详见王艳的第一篇文章。

  本文主要参考了Barrick Lab2的净化方案,并结合自己的净化经验对细节进行了优化。

  主要材料

  BL21(DE3)感受态细胞(商品或自制)

  LB培养基(固体和液体)

  卡那霉素原液(10mg/ml,MP实验室常用浓度)

  -20冰箱

  紫外分光光度计

  法式压榨(更流行的是超声波破碎机)

  IPTG(100万储备溶液)

  PMSF或其他蛋白酶抑制剂

  一次性离心管耗材,50mL,15mL,康宁等品牌。

  高速离心管(纳尔金)

  高速离心机(最好具有冷冻功能)

  温控水浴

  镍-NTA填料(Qiagen)

  即用型透析袋(蛇皮,10kDa MWCO)

  磁搅拌器

  PCR仪器

  台式离心机和其他常用的实验室仪器和消耗品。

  表达质粒

  pET28a-Pfu-sso7d .见序列巴里克实验室。

  缓冲液

  裂解/柱平衡液:

  50毫米磷酸二氢钠

  300毫米氯化钠

  10-20毫米咪唑

  用氢氧化钠将pH值调节至8.0和25。

  清洗液:

  50毫米磷酸二氢钠

  300毫米氯化钠

  40 mM咪唑

  用氢氧化钠将pH值调节至8.0和25。

  如果使用AKTA或类似的色谱系统,线性咪唑浓度可以通过色谱系统形成,因此不需要制备清洗液。在手动纯化过程中,也可以通过配比平衡溶液和洗脱液来获得适当的浓度。但那些不擅长化学或数学的人,最好提前做好准备。

  洗脱液:

  50毫米磷酸二氢钠

  300毫米氯化钠

  250米

M 咪唑

使用NaOH调节pH至8.0,25℃

聚合酶储存缓冲液

50% 甘油

30 mM Tris-HCl,pH 8.0

0.1 mM EDTA

0.1% NP 40(或者其他去垢剂,如TWEEN 20)

1 mM DTT

蛋白表达

规模:2个500mL的LB液体培养。

第一天:转化pET 28a-Pfu-sso7d质粒到含Kan抗性的LB平板。

第二天:挑取单克隆菌落,以2-3mL液体培养摇菌。最好做一次菌落/菌液PCR以验证单菌落非污染,引物为通用引物T7、T7Ter,或者Pfu序列特异性引物。

晚上转接10mL的液体培养基,过夜培养。

第三天:以1%的量接500mL LB培养基,加入0.5%-1%的葡萄糖以抑制基底(渗漏)表达,减低毒性。

37℃ 200rpm震荡培养,至OD600到0.6-0.1。加入终浓度0.5mM-1 mM的IPTG。

继续培养2-4小时。

如夜间加班做实验,则收集菌体后立即进行破碎。如不打算加班,则收集菌体后-80℃保存。

蛋白纯化

第四天(或者第N天,菌体在-80℃冰箱可以存放很长时间)

以1g湿重-10mL 裂解液的比例加入裂解液,悬浮。加入PMSF至终浓度1mM。

超声破碎。

在70℃加热15-30 min。此时宿主蛋白大部分变性失活。

4℃ 以最大或者接近最大转速离心30 min,取上清。

使用0.22uM滤膜过滤,滤液即可加入到纯化柱内进行柱纯化操作。

(在此描述步骤为依靠重力的手动Ni-NTA纯化操作方法)

使用5倍柱床体积(Column Volume,CV)的去离子水清洗纯化柱,除去20%保存液,然后以5倍CV的裂解液平衡纯化柱。

以5倍CV 的清洗液洗杂蛋白。

使用约1CV的洗脱缓冲液,洗脱目的蛋白。

透析:

透析旨在除去高浓度咪唑以及NaCl,将酶置换到储存缓冲液中。

因酶储存缓冲液含50% 甘油,因此通常透析结束时酶溶液体积会缩小。

剪切合适长度的一段Snakeskin透析膜,夹住一头,将洗脱的酶溶液加入透析膜中,再用夹子封住另一端口。

4℃透析3小时以上,或者过夜之后换新的储存液。一般三次换液可认为透析完全。

酶浓度与活性测试

将透析后所得酶转移到合适的管内,-20℃保存。

取其中小量,稀释成一系列梯度,通过SDS-PAGE检测纯度与蛋白大小。

活性测试

将梯度浓度的Pfu-sso7d与商品的酶进行PCR,进行活性对比,如Phusion,或者NEB Q5 DNA polymerase。

可在NEB购买商品化的反应Buffer。或者自己配置

以下Buffer配方可用

5X HF Phusion Buffer

150 mM Tris-HCl pH 10

50 mM KCl

50 mM NH4OAc

10 mM MgSO4

0.5% Triton X-100

0.5 mg/mL BSA

PCR反应体系与热循环参数

Reaction Mix

Reagent

Volume/ul

Water

12.4

dNTP (10mM)

0.4

5× buffer

4

Primer F (10uM)

1

Primer R (10uM)

1

Template (2ng/ul)

1

Diluted polymerase

0.2

Cycle

Temperature

Duration (secs)

Initial denaturation

98

30s

Repeat Cycle 30×

Denaturation

98

10s

Annealing

69

20s

Extension

72

30s / kbp

End Cycle

Final extension

72

5m

可以用简单的模板,如质粒DNA扩增2-6kb片段进行酶活浓度测定

如需更为精确优化配方,还需更多测试。

至此,一个可以使用多年的快速高保真Pfu聚合酶就基本完成了。经历如此复杂的过程其核心动力在于经济考虑。

试想一个PCR试剂用量大的实验室一年可以从PCR Mix自产自足中节省多少经费?

更为重要的是,PCR试剂自由,那种做起PCR来不要钱的感觉,真的很爽!

成本核算

Pfu-sso7d基因合成:2600bp,约2600元

Snakeskin:约1600一卷

其它,能够表达纯化蛋白的实验室常备,边际成本可以接近于零。

时间:看是谁的时间,这个无法衡量。

MMLV、Pfu-sso7d国外学者自产(homemade)鉴定图

图片源自网络平台3

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作为一家新兴的分子生物学酶研发、生产、销售公司,我们致力于为客户提供性能先进、质量可靠的生命科学科研试剂。同时我们也注意到部分客户对于某些产品价格偏高的不满,以及对DIY的渴望,由此,我们也试想能否取得某种平衡:

即公布一般性的高保真酶纯化方法,同时为了避免质粒合成的重复浪费,我们很乐意有偿提供Pfu-sso7d表达质粒(不高于全新合成一个2600bp左右基因的价格),以及高质量、更为实惠价格的dNTP(大批量进口,分装)。

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如需dNTP,请访问我们的官方淘宝店铺:Catascis(开拓赛思)

参考文献:

1.Yan Wang, et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Res. 2004; 32(3): 1197–1207.

2.https://barricklab.org/twiki/bin/view/Lab/ProtocolsReagentsPfuSso7d

3.Vonesh,et alMcQ – An open-source multiplexed SARS-CoV-2 quantification platform. https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.12.02.20242628v1.full

4.https://barricklab.org/twiki/pub/Lab/ProtocolsReagentsPfuSso7d/6his-pfu-sso7d-pET28.gbk

附录

pET28a-Pfu-sso7d序列4

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